細胞培養とは？
細胞培養
細胞培養とは、自然環境の外で制御された条件下で細胞を増殖させるプロセスを指します。 これは、細胞生物学と疾患メカニズムの理解を促進する in vitro ツールです。 また、薬物毒性試験や薬物動態・薬力学研究などの創薬や、個別化医療においても役割を果たしています。
アメリカの発生学者ロス・グランビル・ハリソンは、20世紀初頭に最初のインビトロ細胞培養技術を開発し、カエルの胚から組織片をインビトロで成長させることに成功しました. 今日、細胞培養は、ポリオ、はしか、おたふくかぜ、その他の感染症に対するワクチンの開発など、無数の発見に役立っています。
接着および懸濁培養
細胞増殖には、接着培養と浮遊培養の 2 つの基本的なシステムがあります。 接着培養は人工基質上で増殖しますが、浮遊培養の細胞は培地に自由に浮遊します。 浮遊状態で自然に増殖する細胞タイプはごくわずかですが（リンパ球など）、多くの接着細胞タイプは浮遊培養に適応できます。
自然に付着した細胞を懸濁液中で培養する理由は 2 つあります。 浮遊培養の最初の利点は、培養容器から細胞を酵素的または機械的に分離する必要がないため、細胞の継代が容易になることです。 第二に、細胞増殖は利用可能な表面積ではなく培地中の濃度によってのみ制限されるため、懸濁培養はスケールアップが容易です。 浮遊培養の主な欠点は、成長パターンを追跡するために毎日の細胞数と生存率アッセイが必要になることですが、接着培養は顕微鏡で簡単に調べることができます。
2D および 3D メソッド
接着培養は、2D 培養と 3D 培養にさらに分けることができます。 2D アプリケーションでは、接着細胞は、細胞培養フラスコなどの平面上で単層システムで増殖します。
細胞培養
2D 技術は単純であるため、細胞の in vivo 環境を模倣することはできません。細胞は通常、複雑な細胞間相互作用を伴う 3 次元構造で成長します。 これが、足場ベースまたは足場なしの技術を使用して成長させることができる 3D 培養を使用していくつかの実験が行われる理由です。
足場ベースの 3D メソッドでは、通常、ハイドロゲル足場で接着細胞を成長させる必要があります。 バイオセラミック、金属、またはポリマーの足場などの代替品も、一部の用途に使用されています。
スキャフォールド フリーの技術は、3 つの異なる方法のいずれかによってスフェロイドを成長させるために使用されます。
強制フロート: 細胞懸濁液を低付着性ポリマー コーティング マイクロ プレートのウェルにロードします。 次に、マイクロプレートを遠心分離して、細胞にスフェロイドを形成させます。
ハンギング ドロップ: 細胞懸濁液をハンギング ドロップ プレートのウェルにロードします。 名前が示すように、懸濁液は液滴としてプレートにかかります。 細胞はこれらの液滴の先端に集まり、球体を形成します。
撹拌ベース: 細胞懸濁液を回転バイオリアクターに入れます。 絶え間ない攪拌により、細胞は壁に接着できず、スフェロイドを形成しました。
細胞培養チャレンジ
方法や技術の違いにもかかわらず、すべての実験には 1 つの共通点があります。それは、再現性のある結果を得るために必要な数の生細胞を増殖させることが難しいということです。 したがって、次のセクションでは、再現性、汚染、実現可能性、および自動化への移行という 4 つの課題に専念します。
再現性
Yongyue Medical の調査によると、科学者の 70% 以上が、他の科学者の実験を再現できなかったと報告しており、半数以上が自分の研究を再現できなかったと報告しています。 細胞培養アッセイでは、ほとんどの再現性の問題は、細胞の継代または世代間の生物学的差異から生じます。 もう 1 つの大きな問題は、細胞株の誤認であり、培養パラメーターの不一致も重要な役割を果たします。
生物学的変異
ランダム変異や転写エラーなどの要因は、細胞が分裂するたびに実験の再現性に影響を与える可能性があります。 これを回避するには、新しいプロジェクトの開始時にセル バンクを作成する必要があります。
セルバンク
セルバンキングとは、再現性に影響を与えるランダムな突然変異や転写エラーなどの要因を回避するために、後で使用するために特定の細胞タイプのバッチを保存するプロセスを指します。 最初のステップは、選択した培養対象の細胞タイプを培養し、それらを複数の容器で凍結保存することにより、マスター セル バンク (MBC) を確立することです。 MBC バッチを解凍し、後で作業セル バンク (WBC) を準備するために使用します。
細胞株の誤認
細胞株の誤認の問題は、科学者が 19 の他のヒト細胞株の HeLa 細胞汚染を説明した 1960 年代から知られていました。 結果の信頼性を確保し、さらに重要なことに、誤った結論を導き出さないようにするために、実験室に持ち込まれるすべての新しい細胞株は、それらの起源が確認されるまで隔離する必要があります。 最も重要なことは、凍結保存と他の研究室への配布の前、およびプロジェクトの完了後に、細胞株の適格性評価を繰り返すことをお勧めします。 細胞株を検証するには、まず、誤認された細胞株レジストリに記載されているかどうかを確認する必要があります。 登録されていない場合でも、その信頼性を確認する必要があります。 ヒト細胞株については、ショート タンデム リピート (STR) 分析 (DNA フィンガープリンティング) をお勧めします。 非ヒト細胞株には、核型分析、アイソザイム分析、ミトコンドリア DNA タイピング (DNA バーコーディング) など、さまざまな検査方法が利用できます。
培養パラメーター
再現性に影響を与える 3 番目の要因は、培養パラメーターです。
たとえば、酸素レベルは培養細胞に大きな影響を与える可能性があります。 ただし、チャンバーのサイズや細胞密度などの酸素化に影響を与える変数は、常に文書化されているわけではないため、一貫性を保つことはできません。
もう 1 つの重要な文化パラメーターは、媒体です。 これは、必須栄養素、成長因子、ホルモンを提供し、pH と浸透圧を調節します。 したがって、最も重要なことは、その構成が常に同じであることです。 これは、ウシ胎児血清 (FBS) を添加した培地製剤にとって特に重要です。FBS の組成は、牛の食事、地理的位置、時期などの要因によって異なります。 結果の再現性に対する FBS の影響を最小限に抑えるには、現在の在庫が少なくなり始めたときに異なるバッチの血清を注文し、それらをテストして最も近いものを見つける必要があります。 他の人があなたの結果を再現できるように、血清をどのようにスクリーニングしたかを報告し、ロット番号を記録する必要があります.
細胞培養
細胞処理
ほとんどの研究者は、培養パラメーターがアプリケーションに大きな影響を与えることを知っていますが、処理技術の変更は見過ごされがちです。
汚染
細胞が組織から分離され、実験室で培養されると、細胞は免疫系によって保護されなくなり、汚染に対して非常に脆弱になります。
汚染の最初の原因は、培養液、血清、サプリメント、または水の不純物などの非生物的汚染物質、ならびにエンドトキシンおよび浸出物です。 注意事項には、細胞培養実験用の実験室グレードの水の使用、およびエンドトキシン試験の認証を提供するメーカーの培地、血清、サプリメント、および消耗品が含まれます。 さらに、プラスチック添加物が細胞培養に浸透しないように、消耗品は未使用のポリスチレンまたはポリプロピレンでできている必要があります。
汚染の第 2 の原因は、細菌 (マイコプラズマを含む)、菌類、酵母などの生物学的汚染物質です。
実現可能性
細胞生存率は、サンプル中の生存細胞の割合として定義されます。 先ほど見た汚染物質に加えて、細胞の生存率に影響を与えるさまざまな要因があります。 環境条件 (温度、pH、浸透圧、栄養素の利用可能性、O2 および CO2 濃度) は非常に重要です。 これらの変数のほとんどは培地によって制御され、細胞タイプに固有であるため、残念ながら特定のガイドラインを提供することはできません.
細胞は圧力に非常に敏感であるため、環境条件だけでなく、液体の取り扱い方法にも注意を払う必要があります。
細胞の生存率に影響を与える最後の要因は老化です。 ほとんどの有限細胞株は、死ぬ前に 20 ～ 60 回の分裂を生き延びます。つまり、再利用できるのは 15 ～ 45 世代の間だけです。 その後、凍結保存されたサンプルを細胞バンクから解凍する必要があります。 継続的な細胞株は無期限に増殖できますが、遺伝的浮動を起こしやすいため、定期的に交換する必要があります。
比色、蛍光、および生物発光法を使用した検出アッセイを使用して、細胞の生存率を測定できます。 一般的に使用される比色法は MTT 法であり、生細胞による黄色のテトラゾリウム塩の紫色のホルマザン結晶への還元に基づいています。
96-ウェルプレート
オートメーション
上記の課題の多くは、細胞培養ワークフローを自動化することで解決できます。 たとえば、細胞の取り扱いは常に一貫しており、再現性と生存率にプラスの影響を与えます。 最も重要なことは、自動化によってユーザー汚染のリスクが軽減されることです。
これらの利点にもかかわらず、ワークフロー全体の自動化は、予算上の理由、ロボット用のスペースの不足、または各ステップを一度に自動化して検証するための十分なリソースがないため、困難な場合があります。 でもこれで解決！
