細胞培養は、細胞生物学および分子生物学で使用される最も重要なツールの 1 つであり、正常な生理学および生化学 (代謝研究、老化など)、細胞に対する薬物および毒性化合物の影響を研究するための優れたモデル システムを提供します。細胞突然変異誘発および発癌の研究。 また、薬物のスクリーニングと開発、および生物学的化合物 (ワクチン、治療用タンパク質など) の大規模生産にも使用されます。 これらのアプリケーションのいずれかに細胞培養を使用する主な利点は、クローン細胞のバッチを使用して得られる結果の一貫性と再現性です。
細胞培養
細胞培養とは、動物や植物から細胞を取り出し、好ましい人工環境で増殖させることを指します。 細胞は組織から直接取り出し、培養前に酵素的または機械的に解離するか、確立された細胞株または株に由来することができます
1. 一次研修
初代培養とは、細胞が組織から分離され、利用可能なすべての基質を占有するまで (つまり、コンフルエントに達するまで) 適切な条件下で増殖された後の培養段階を指します。 この段階で、継続的な成長のためのより多くのスペースを提供するために、新鮮な成長培地を含む新しい容器に細胞を移すことによって、細胞を継代培養 (すなわち、継代) する必要があります。
2. 細胞株
最初の継代培養の後、初代培養は細胞株またはサブクローンと呼ばれます。 初代培養に由来する細胞株の寿命は有限であり（つまり、有限です）、継代すると、増殖能が最も高い細胞が優勢になり、集団の性別である程度の遺伝子型および表現型の均一性が得られます。
3. 細胞株
細胞株の亜集団が、クローニングまたは他の方法によって培養物から積極的に選択される場合、細胞株は細胞株になります。 細胞株は、親株が開始された後に追加の遺伝的変化を獲得することがよくあります。
4. 限定細胞株と連続細胞株
通常、正常な細胞は限られた回数だけ分裂してから増殖能力を失います。これは老化と呼ばれる遺伝的に決定された現象です。 これらの細胞株は有限と呼ばれます。 ただし、一部の細胞株は、形質転換と呼ばれるプロセスを通じて不死になります。このプロセスは、自然に発生するか、化学的またはウイルス的に誘導されます。 有限細胞株は、形質転換を受けて無限に分裂する能力を獲得すると、連続細胞株になります。
継続的に培養された細胞株は遺伝的ドリフトを起こしやすく、有限の細胞株は老化する運命にあり、すべての細胞培養は微生物汚染の影響を受けやすく、設備の故障は最高の状態で運営されているラボでも発生する可能性があります. 確立された細胞株は、交換に費用と時間がかかる貴重なリソースであるため、長期保存のために凍結保存することが不可欠です。
継代培養から少数の残りの細胞が得られたら、それらをシードストックとして凍結し、一般的な実験室での使用から保護する必要があります。 作業用ストックは、凍結種子ストックから調製および補充できます。 種子ストックが枯渇した場合、凍結保存された作業ストックを新鮮な種子ストックを準備するためのソースとして使用でき、最初の凍結からの量の増加を最小限に抑えることができます。
培養細胞を凍結保存する最良の方法は、ジメチルスルホキシド (DMSO) やグリセロールなどの凍結保護剤の存在下で、液体窒素、完全培地で行うことです。 凍結防止剤は培地の凝固点を下げ、冷却速度も低下させ、細胞に損傷を与えて細胞死に至る可能性のある氷晶形成のリスクを大幅に減らします。
DMSO は、組織への有機分子の侵入を促進することが知られています。 ジメチルスルホキシドを含む試薬を取り扱う際は、この物質の危険性に適した機器と手順を使用する必要があります。 地域の規制に従って試薬を廃棄してください。
凍結ワーキングセルストックから細胞を増殖
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継代数を決定します。たとえば、前の細胞が凍結され、3 回解凍された場合、解凍プロセスは 4 回目の継代になります。
細胞株、継代数、および日付で標識された T75 フラスコに増殖培地 (最小培地、子牛血清、および抗生物質) を追加します。
少なくとも 15 分間、37 度、5% CO で CO インキュベーターにフラスコを水平に置きます。 これにより培地が温まり、通常の pH (7.0-7.6) に戻ります。
細胞株を含む凍結バイアルを 37 度の水浴で穏やかに攪拌しながら解凍します。 汚染のリスクを軽減するために、O リングとキャップを水位より上に保ちます (2-5 分間)。
バイアルを生物学的安全キャビネット (BSL-2) に置きます。 汚染を避けるため、バイアルを開ける前に 70% エタノールで拭き取ってください。
凍結細胞フラスコの内容物を増殖培地を含む T75 フラスコに移します。 フラスコを穏やかに混ぜて振って、フラスコの表面に細胞を均等に分散させます。
5 パーセントの CO2 で 37 度の CO2 インキュベーターでフラスコを一晩インキュベートします。 細胞を一晩付着させます
成長媒体の変更
フラスコをさらに 2-4 日間 37 度、5% CO2 で培養し、細胞が増殖するまで監視します
細胞が約 90% のコンフルエントに達したら、T150 フラスコを使用して細胞ストックを拡張できます。