卒業して就職したばかりのとき、リアルタイムの定量的 PCR 実験に直面している名詞の束に直面しています。 どこから始めればよいか混乱していますか？ 増幅曲線、検量線、閾値、CT値、融解曲線、ベースラインとは？ これらの実験の蛍光画像は明るすぎますが、識別できないようです。 今日は、これらの知識と概念について、技術用語とよくある質問の 2 つの部分で説明します。
パート I 専門用語
1.増幅曲線
増幅曲線とは、サイクル数を横軸に、反応中のリアルタイム蛍光強度を縦軸にとった曲線を指す。
2. ベースライン
ベースラインとは、PCR 増幅反応の最初の数サイクルで蛍光シグナルがほとんど変化しないことを指します。 信号レベルは、ベースラインである直線に近いことを示しています。
3. 蛍光閾値設定
通常、PCR反応の最初の15サイクルの蛍光シグナルが蛍光バックグラウンドシグナルとして使用され、蛍光閾値は、PCRの3-15サイクル中の蛍光シグナルの標準偏差の10倍であり、蛍光閾値はPCR 増幅の指数期に設定されます。 通常、各機器には使用前の蛍光閾値があります。
4.CT値
CT 値は、蛍光シグナルが設定されたしきい値に達したときに、各 PCR 反応チューブで発生するサイクル数を表します。 研究から、各テンプレートの CT 値とそのテンプレートの開始コピー数の対数の間に線形関係があることがわかっています。 初期コピー数が多いほどCT値は小さくなり、逆もまた同様です。 開始コピー数が既知の標準を使用して、横軸が開始コピー数の対数を表し、縦軸が CT 値を表す検量線を作成できます。 したがって、未知のサンプルの CT 値が得られれば、検量線からサンプルの初期コピー数を計算できます。
もっと知る
増幅曲線が良好かどうかを判断する指標はいくつかあります。
回答: 曲線の変曲点は明らかです。特に低重量画分のサンプルの指数関数的な段階は明らかです。増幅曲線の全体的な平行性は非常に良好で、ベースラインは平坦で、上昇現象はなく、増幅は低レベル指数相濃度サンプルの曲線は非常に良好です。 明らか。
B: 曲線の指数関数的段階の傾きは増幅効率に正比例し、傾きが大きいほど増幅効率が高くなります。
C: 標準的なベースラインは横ばいまたはわずかに減少しており、明らかな上昇傾向はありません。
Ｄ：各チューブの増幅曲線の平行性は良好であり、各反応チューブの増幅効率が類似していることを示している。
5. 融解曲線
PCR産物を加熱すると、温度が上昇するにつれて二本鎖増幅産物が徐々に解離し、蛍光強度が低下します。 一定の温度に達すると、大量の生成物が分離し、蛍光が急激に減少します。 この機能を異なる PCR 産物の異なる TM 値と共に使用すると、蛍光シグナルが急速に減少する温度も異なります。これは、PCR の特異性を識別する良い方法かもしれません。
6. 融解曲線（対数曲線使用）
ピークグラフは、融解曲線の対数によって形成され、生成物のフラグメントの状況をより直感的に表示します。 融解温度は DNA フラグメントの TM 値であるため、DNA フラグメントの TM 値に影響を与える特定のパラメーター (フラグメント サイズ、GC 含有量など) を決定できます。増幅産物の長さが 80-300 bp の範囲にあり、融解温度が 80 度から 90 度の間であること。
A: 80 度から 90 度の間に主なピークが 1 つしかない場合、リアルタイム PCR が完全であることを意味します。
B: 主ピークが 80 度から 90 度の間に現れ、不純物ピークが 80 度未満に現れる場合、基本的にプライマーダイマーが考えられます。 これは、アニーリング温度を上げることで解決しようとする良いオプションです。
C: 80 度から 90 度の間に主ピークが現れ、温度が上昇するとさまようピークが現れる場合は、基本的に DNA の混入が考えられます。 また、実験の初期段階で DNA を除去する必要があります。
7. 標準曲線
標準標準を異なる濃度に希釈し、PCR 反応のテンプレートとして使用しました。 標準曲線は横軸に標準コピー数の対数、縦軸に測定したCT値をとってプロットしたものである。 未知のサンプルを定量する場合、未知のサンプルの CT 値に基づいて検量線からサンプルのコピー数を取得できます。 標準曲線は、絶対定量にとって非常に重要です。
第二部。 よくある問題
Q1: RT-PCR、QPCR、リアルタイム PCR、リアルタイム RT-PCR の違いは何ですか?
A1: RT-PCR は逆転写 PCR であり、ポリメラーゼ連鎖反応の変形として広く使用されています。 RT-PCR では、RNA 鎖が逆転写されて相補的な DNA になり、これが PCR のテンプレートとして使用され、PCR によって DNA が増幅されます。
リアルタイム PCR と QPCR は同じものです。どちらもリアルタイム定量 PCR です。つまり、PCR プロセス中の各サイクルでデータがリアルタイムで記録されます。 このようにして、スタートアップ テンプレートの数を正確に分析できます。
リアルタイム PCR と逆転写 PCR はどちらも RT-PCR と略されるように見えますが、国際的な慣習では、RT-PCR は特に逆転写 PCR を指し、リアルタイム PCR はしばしば qPCR (Quantitative Real- True Real-True Real PCR ) - 時間 PCR)。
リアルタイム RT-PCR (RT-QPCR) は、蛍光定量技術を組み合わせた逆転写 PCR の一種です。最初に RNA から逆転写して cDNA を取得し (RT)、続いてリアルタイム PCR (QPCR) を使用して定量分析を行います。
Q2: 蛍光定量 PCR の増幅産物断片の長さが 80-300 bp の範囲に制御されているのはなぜですか?
A2: それぞれの遺伝子配列の長さは異なり、中には数 Kb から数百 BP のものもあります。 ただし、プライマーを設計する場合、生成物の長さは 80-300 bp であれば十分であり、短すぎても長すぎても定量的 PCR 検出には適していません。
生成物のフラグメントは短すぎて、プライマーダイマーと区別できません。 プライマーダイマーの長さは30-40bp程度で、80bp未満ではプライマーダイマーなのか生成物なのか判別が難しくなります。 生成物断片が300bpを超える長すぎると、増幅効率が低下しやすく、遺伝子量を効果的に検出できません。
たとえば、教室の人数を数える場合、口の数を数えればよいのです。 遺伝子を検査するときも同じことが言えます。 配列全体を表すには、遺伝子の特定の配列を検出するだけで済みます。 人を数えるのに口と鼻、耳とメガネの両方を数えていると間違えやすいです。
Q3: プライマーの設計に最適な長さは?
A3: 一般的に言えば、20-24 bp の範囲のプライマーの長さが良いです。 もちろん、最適なアニーリング温度に関連するため、プライマーを設計する際にはプライマーの TM 値に注意を払う必要があります。 多くの実験の後、60 度が良好な TM 値であることが証明されました。 アニーリング温度が低いと非特異的な増幅が起こりやすく、アニーリング温度が高いと通常、増幅効率が低くなり、増幅曲線のピークが遅くなり、CT 値が遅くなります。
質問 4: 収集されたサンプルの量は実験結果に影響しますか?
A4: いいえ。明らかに、より多くのサンプルを収集すればするほど、より多くの RNA が抽出され、より多くの cDNA が生成され、より多くのターゲット フラグメントが生成されます。 絶対定量のためには、ターゲットフラグメントのコピー数を計算する必要があり、収集されたサンプルの量は間違いなく実験結果に影響します。 例えば、血液中のC型肝炎ウイルスHBVの検出は、一定量(1ml)の血液中のHBVの含有量を検出することです。
科学研究で一般的に使用される相対定量の場合、相対定量は標的遺伝子と参照遺伝子の比較を指すため、サンプル数は実験結果とは関係ありません。 ただ、同じ核酸鎖に存在する上流と下流の断片と考えてください。 サンプルサイズが大きい場合、リファレンス遺伝子とターゲット遺伝子の両方が同時に同じ割合で増加しますが、結果には影響しません。
Q5: 逆転写酵素の効率は実験結果に影響しますか?
A5: 同上です。 より高い RT 効率が必要であることに注意してください。ただし、RT 酵素が比較的安定しており、均一な結果が得られることを好みます。 これは、大手企業の逆転写スイートの最適化された機能のテストになります。
質問 6: TAQ 酵素の効率は実験結果に影響しますか?
A6: TAQ酵素の効率は比較的大きいです。 通常、ホットスタート taq 酵素が必要であり、比較的効率的です。 市販の蛍光定量キットは、各メーカーが100％に近い自社製品に合わせて最適な状態の効率を最適化しますが、効率が低すぎると実験結果が得られません。 さまざまな企業の製品の場合、これは品質の尺度です。
質問 7: 蛍光色素の量は実験結果に影響しますか?
A7: はい。 蛍光色素が飽和しすぎると、一部の機器でノイズ干渉を引き起こす可能性があります。 蛍光色素が飽和しておらず、蛍光値が低すぎる場合、早期にプラトー期に入り、増幅曲線は平坦になります。 蛍光定量実験では主に CT 値が見られるため、後期増幅曲線がプラトー段階に入ることは重要ではありませんが、画像は十分に美しくありません。 選択する必要がある場合は、飽和度がわずかに低い蛍光色素を選択することから始めます。 ただし、同じ会社の同じ製品を使用する場合、その影響は基本的に無視できます。
質問 8: PCR チューブの透過率は実験結果に影響しますか?
A8: はい。 ただし、同じメーカーの同じバッチの消耗品の場合、この影響は無視できます。 これは良い選択であり、消耗品の光透過率の影響を最小限に抑えるために、透過性の高いメンブレンを備えた 96- ウェル プレートを使用するのが最善です。
Q9: 操作中のエラーは実験結果に影響しますか?
A9: 操作プロセスの影響は、主に均一性に反映されます。 均一性とは、システム内のすべての成分が均一に混合されることを意味し、フラッシュ遠心分離はこの問題を解決できます。 さらに、初心者の場合、PCR システムを 20 インチ以上に調整するのが最善であり、システムが小さすぎるとエラーが発生しやすくなります。 アニーリング温度が正しく最適化されていれば、CT に対するプライマー濃度の影響は最小限に抑えられます。 また、アニーリング温度を最適化することで、一部の操作エラー (プライマー濃度など) を回避できることがわかります。
要約する
上記は、実験中に初心者がよく遭遇するいくつかの質問と質問です。これらの質問が混乱を解決するのに役立つことを願っています. 実験とは、混沌を生み出し、問題を解決するプロセスです。うまくいけば、そこから何かを得ることができます。 読んでくれてありがとう。また次回お会いしましょう！
